ХИМИЯЛЫҚ АНТИГЕНДІК РЕЦЕПТОРЛАРДЫ (CAR-T) БІЛДІРЕТІН АУТОЛОГИЯЛЫҚ ГЕНЕТИКАЛЫҚ ТҮРЛЕНДІРІЛГЕН Т-ЛИМФОЦИТТЕРДІ АЛУ ТЕХНОЛОГИЯСЫН ЖАСАУ ЖӘНЕ ЛЕЙКОЗЫ БАР ПАЦИЕНТТЕРГЕ АДАПТИВТІ ИММУНОТЕРАПИЯ ҮШІН CAR-T-ЛИМФОЦИТТЕРДІ ҚАБЫЛДАУ

«Қазақстан Республикасында дербестендірілген және превентивті медицинаны енгізудің ұлттық бағдарламасы» ғылыми-техникалық бағдарламасын іске асыру шеңберінде

Өзектілігі

Қазақстан Республикасында лейкоздың жаңа жағдайларының жиілігі жылына 100 мың адамға 4,4 жағдай. Қазақстан Республикасында гематологиялық ісіктері бар пациенттерді емдеу химиотерапияға сүйенеді. Кейбір жағдайларда миелоаблативті немесе лимфоаблативті терапия науқастың өмірін сақтаудың соңғы шегі ретінде қолданылады, содан кейін сүйек кемігін трансплантациялайды, бірақ мұндай пациенттердің саны аз. Аталған терапевтік тәсілдердің ешқайсысы жедел лейкемиямен ауыратын науқастарды толық емдеу әдісі емес, бірақ уақытша ремиссияға әкеледі.

Бүкіл әлемде қатерлі ісік ауруын емдеудің жаңа тәсілдерін іздестіру ісікке бағытталған жеткізуді немесе иммуносупрессивті реакцияларды (BNCT, CAR-T) қолдана отырып, емдеудің инновациялық әдістерін жасауға әкелді. Эксперименттік терапевтік тәсілдерге бақылау жолдарының ингибиторларын, ісікке қарсы вакциналарды, эффекторлық молекулалармен байланысқан антиденелерді және адаптивті жасушалық терапияны қолдану жатады. Қазіргі уақытта қатерлі ісік терапиясында кеңінен қолданылатын әдістердің қатарына иммунотерапия жатады. Қазіргі заманғы қатерлі ісік иммунотерапиясы пациенттің цитотоксикалық (CD8+) т-лимфоциттерін (CTL) ісік жасушаларына бағыттау үшін, сондай-ақ пациенттің денесіндегі ісікке тән CTL мөлшерін едәуір арттыру үшін жасушалық инженерия мүмкіндіктерін пайдаланады. Донорлық лимфоциттердің гетерогенді популяциясындағы CTL иммунологиялық ерекшелігін өзгерту мүмкіндігі маңызды жетістік болды, сондықтан өзгертілген CTL ісік жасушаларының бетінде таңдалған белгілі маркер антигенін нақты тану және маркер антигенін білдіретін жасушаларды өлтіру мүмкіндігіне ие болды. Соңғы жетістік генетикалық инженерияның жетістіктерінің арқасында мүмкін болды. Екі технологияның – жасушалық инженерия мен генетикалық инженерияның синтезі «т-лимфоциттің химиялық антигендік рецепторларының технологиясы» немесе CAR-T деп аталатын инновациялық әдістің пайда болуына әкелді, бұл гематологиялық көрсеткіштер мен өмір сүру ұзақтығының жоғарылауымен өлшенетін жоғары терапиялық тиімділікті көрсетеді. Кейбір жағдайларда CAR-T терапиясы B жасушалық неоплазиясы бар науқастарда, әсіресе жедел лимфобластикалық лейкемиямен ауыратын науқастарда ұзақ мерзімді ремиссияға әкелді. CAR-T терапиясын қолданғаннан кейін пациенттердің 70-90%-ында айтарлықтай жақсару байқалады.

CAR-T адаптивті жасушалық терапиясы қазіргі уақытта революциялық емдеу ретінде қабылданады, өйткені CAR-T-ден кейін рефрактерлі (дәстүрлі емдеу әдістеріне жауап бермейтін) қатерлі ісігі бар кейбір науқастарда тұрақты ремиссия байқалады. CAR-T терапиясы-бұл жеке медицинаның танымал бағытының мысалы.

CAR-T терапиясының маңызды мәселесі-бұл технологияның қазіргі уақытта нарықта үлкен бағасы. Қазіргі уақытта АҚШ-та CAR-T екі сатушыны сатады: Gilead (терапевтік қызмет Yescarta брендімен сатылады) және Novartis (терапия Kymriah деп аталады). Екі терапевтік мүмкіндік қатерлі ісік ауруын емдеудің ең қымбат әдісі болып табылады, сәйкесінше бір курс үшін 373 000 доллар және бір науқасқа 475 000 доллар. Мұндай бағалар кезінде лейкозбен ауыратын науқастардың басым көпшілігі, егер CAR-T технологиясы үшін өзінің технологиялық базасын дамытпаса, Қазақстан Республикасында CAR-T терапиясын ала алмайды, әзірге Қазақстанда CAR-T терапиясының шетелдік тәжірибесін әзірлеу немесе енгізу бойынша жұмыстар жүргізілмейді және бейімделгіш жасушалық терапияның ешқандай балама тәсілдері қолданылмайды. Әлемде тірі (жасушалық) таргеттеуші жүйелер болашақтың онкогематологиясын дамыту басымдықтарына жататынын ескере отырып, Қазақстан Республикасында адаптивті жасушалық терапияны дамыту қажет. CAR-T терапиясы Қазақстан Республикасындағы науқастар үшін қаржылық қолжетімді болуы үшін негізгі кезеңдерді барынша оқшаулай отырып, CAR-T терапиясының бағасын төмендету аса маңызды мақсат болуы тиіс.

Үшінші міндеттің нәтижесінде I фазаның клиникалық сынақтар сатысында елдегі бірінші CAR-T терапия ХАТТАМАСЫ жасалатын болады. Жобаның алғашқы жоспарланған нәтижесі-жедел лимфобластикалық лейкоздағы ісік жасушаларына қарсы бағытталған цитотоксикалық т-лимфоциттерді өндіру технологиясы отандық онкогематологияға адаптивті жасушалық терапияны енгізу үшін клиникалық хаттаманы құру кезінде қажетті қадам болып табылады.

Осы зерттеудің мақсаты

Химиялық антигендік рецепторларды (CAR-T) білдіретін аутологиялық генетикалық түрлендірілген т-лимфоциттерді алу технологиясын жасау арқылы лейкозы бар пациенттерге адаптивті иммунотерапия үшін CAR-T-лимфоциттерді қолдану.

Зерттеу міндеттері

ИММУНОМАГНИТТІК бөліну арқылы CD8+ лимфоциттердің бөлінуі, Т-лимфоциттердің активтенуі.
CAR-T векторымен Т-лимфоциттердің трансдукциясын жүргізу.
Car-Т-лимфоциттердің in vitro цитотоксикалық белсенділігін өлшеу. Clinimacs prodigy (Miltenyi Biotec) станциясында лимфоциттерді өсіру.
Жануарларға жүргізілген тәжірибелерде CAR-T-лимфоциттердің ісікке қарсы белсенділігін бағалау.

Зерттеу әдістері:

Т-лимфоциттердің жаңа алынған қаннан бөлінуі. Бүкіл қан гепарин ерітіндісі бар пробиркаларға жиналады. Эритроциттер гипотоникалық буфердегі лизиспен жойылады. Лейкоциттер центрифугалау арқылы тұндырылады және фикол градиентінде центрифугалау арқылы фракцияланады, моноциттердің фракциясын таңдаймыз. ИММУНОМАГНИТТІК бөліну арқылы CD8+ лимфоциттердің бөлінуі: жасушалар CD8-ге қарсы биотинилденген антиденелермен араласады, артық антиденелер алынып, жасушалар стрептавидинмен қапталған магниттік микробөлшектерге адсорбцияланады. Әрі қарай таңдау MACS LS (Miltenyi Biotec) бағанында жүзеге асырылады. CD8 + лимфоциттердің бастапқы культурасының өміршеңдігін бағалау МТТ-тест әдісімен орындалады.
Т-лимфоциттердің активтенуі. T-лимфоциттердің бастапқы культурасына CD3 және CD-ге қарсы антиденелермен қапталған микробөлшектер қосылады инкубация ортасында IL2 (40 U/ml) қосылады. Пролиферацияны белсендіру үшін жасушалар 72 сағат инкубацияланады.
Т-лимфоциттердің лентивирустық трансдукциясы. Трансдукция векторын орау үшін плазмид қоспасы: CD19 CAR, апоптоз индукциясы геномы және басқа да қажетті гендері бар вектор PVSV-G және pGAG-POL орам плазмидтерімен HEK293T мәдениетіне араласады. Оралған вектордың дайындық мөлшерін алу үшін Трансфекция (>5×10^7 ffu) полиэтилениминнің көмегімен T150 культуралық бөтелкелерде жасалады. Вирус трансфекциядан кейін 1-3 тәулікке жиналады. Титрлеу сандық ПТР және флуоресцентті ақуызды (GFP) білдіретін Трансдукция векторын орау арқылы жүзеге асырылады, содан кейін вектор мен gfp оң жасушаларын санау арқылы аңғал мәдениетті жұқтырады.
CAR-T-лимфоциттер культурасын дайындау. Пролиферацияға белсендірілген т лимфоциттері VSV-G ақуызымен псевдотиптелген лентивирус вириондарына оралған вектормен тасымалданады (соңғысы кең тропизмді және лимфоциттерді жұқтыру қабілетін қамтамасыз етеді). MOI = 5 инфекциясының көптігі қолданылады. CAR-T-лимфоциттердің (>10^7 жасуша) препараттық мөлшерін өндіруге t шишаларындағы лимфоциттердің бастапқы мәдениетін жұқтыру арқылы қол жеткізіледі, инкубация ортасына Трансдукция тиімділігін арттыру үшін полибрен қосылады. Пролиферативті белсенділікті сақтау үшін жасушалар цитокиндердің қатысуымен (IL2, IL6) инкубацияланады. Трансдукциядан кейін 24 сағаттан кейін культураға пуромицин (1-10 мкг/мл) қосылады [18]. Мәдениет in vitro және in vivo эксперименттеріне дейін трансдукцияланбаған (CAR-T емес) лимфоциттерді жою үшін пуромицинмен ортада өсіріледі.
CD19 car-Т-лимфоциттердің in vitro цитотоксикалық белсенділігін өлшеу. Тышқан CAR-T-лимфоциттерімен жүргізілген тәжірибелерде сынақ мәдениеті ретінде тышқан в-лимфомасы А20 қолданылады. Донорлық адам CAR-T-лимфоциттерімен эксперименттерде тест мәдениеті ретінде адам тектес B-лимфобласттары қолданылады: K562 және Raji. В лимфобласттары мен CAR-T лимфоциттері 1:1 қатынасында (CAR-T/B) мәдени планшеттерге бірге себіледі. Спецификалық емес реакцияларды бақылау ретінде CAR-T-лимфоциттердің орнына модификацияланбаған Т-жасушалар пайдаланылатын болады. Бірлескен дақылдар 24 сағат инкубацияланады, содан кейін инкубация ортасы IFNγ және IL12 өлшеу үшін коммерциялық ИФТ жиынтығымен жиналады. Дақылдардың тығыздығы (цитотоксикалық белсенділіктің тікелей көрсеткіші) MTT тестінде өлшенеді.
Клиникалық зерттеу жағдайында қолдану үшін алынған емдік жасушаларды культивациялау және көбейту. Алынған буут клеткалық популяциясы CliniMACS prodigy (Miltenyi biotec) автоматтандырылған станциясында өсіріледі. Ұяшықтарды өсіру үшін қажетті реагенттер мен компоненттер GMP талаптарына сәйкес келеді. Зертхананың жағдайында алынған CD19 CAR-T-лимфоциттер үшін стерильділік сақталады және өндірістік стандарттар пысықталатын болады.