СОЗДАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ АУТОЛОГИЧЕСКИХ ГЕНЕТИЧЕСКИ-МОДИФИЦИРОВАННЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ (CAR-T), И ПРИМЕНИЕ CAR-T-ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ АДАПТИВНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ ПАЦИЕНТОВ С ЛЕЙКОЗОМ

в рамках реализации научно-технической программы «Национальная программа внедрения персонализированной и превентивной медицины в Республике Казахстан»

Актуальность

Частота новых случаев лейкоза в Республике Казахстан – 4,4 случая на 100 тыс. человек в год. В Республике Казахстан лечение пациентов с гематологическими опухолями опирается на химиотерапию. В ряде случаев в качестве последнего рубежа в сохранении жизни больного применяется миелоаблативная или лимфоаблативная терапия с последующей трансплантацией костного мозга, однако количество таких пациентов невелико. Никакой из перечисленных терапевтических подходов не является способом полного излечения пациентов с острым лейкозом, но приводит к временной ремиссии.

Продолжающиеся во всём мире поиски новых способов лечения рака привели к созданию инновационных методов лечения, использующих направленную доставку в опухоль или иммуно-опосредованные реакции (BNCT, CAR-T). Экспериментальные терапевтические подходы включают применение ингибиторов контрольных путей, противоопухолевых вакцин, антител, конъюгированных с эффекторными молекулами, и адаптивную клеточную терапию. К числу методов, которые в наше время всё более широко применяются в терапии рака, относится иммунотерапия. Современная иммунотерапия рака использует возможности клеточной инженерии для того, чтобы направить на опухолевые клетки собственные цитотоксические (CD8+) Т-лимфоциты пациента (CTL), а также существенно увеличить количество опухолеспецифических CTL в организме пациента. Важным достижением стала возможность изменять иммунологическую специфичность CTL в гетерогенной популяции донорских лимфоцитов, так что изменённые CTL получают способность специфически распознавать выбранный известный маркёрный антиген на поверхности опухолевых клеток и убивать клетки, экспрессирующие маркёрный антиген. Последнее достижение стало возможным благодаря успехам генетической инженерии. Синтез двух технологий – клеточной инженерии и генетической инженерии – привёл к появлению инновационного метода, получившего название “технология химерного антигенного рецептора Т-лимфоцита” или CAR-T, которая показывает высокую терапевтическую эффективность, измеряемую по гематологическим показателям и по увеличению продолжительности жизни. В ряде случаев CAR-T терапия привела к многолетней ремиссии у пациентов с B-клеточными неоплазиями, в особенности, с острым лимфобластным лейкозом. Заметное улучшение наблюдается у 70-90% пациентов после применения терапии CAR-T. Федеральное агентство по контролю за лекарствами США (FDA) разрешило широкое клиническое применение CAR-T для лечения острого лимфобластного лейкоза.

Адаптивная клеточная терапия CAR-T в настоящее время воспринимается как революционное лечение по той причине, что у некоторых пациентов с рефрактерным (не отвечающим на традиционные способы лечения) раком после CAR-T наблюдаются стойкие ремиссии. CAR-T терапия — пример всё более популярного направления персонализированной медицины.

Важная проблема CAR-T терапии заключается в огромной цене, которую в настоящее время эта технология имеет на рынке. В США в настоящее время CAR-T продают два поставщика: Gilead (терапевтическая услуга продаётся под брендом Yescarta), и Novartis (терапия называется Kymriah). Обе терапевтические возможности являются самыми дорогими среди известных методов лечения рака, соответственно: 373 000 USD за курс, и 475 000 USD на одного пациента. При таких ценах абсолютное большинство больных с лейкозом в Республике Казахстан не смогут получить CAR-T терапию, если не развивать собственную технологическую базу для технологии CAR-T. Пока что в Казахстане не ведутся работы по разработке или внедрению зарубежного опыта CAR-T терапии и не применяются никакие альтернативные способы адаптивной клеточной терапии. С учётом того, что в мире живые (клеточные) таргетирующие системы относятся к приоритетам развития онкогематологии будущего, необходимо развивать адаптивную клеточную терапию в Республике Казахстан. Особо значимой целью должно быть снижение цены CAR-T терапии, с максимальной локализацией ключевых этапов, для того чтобы CAR-T терапия стала финансово доступной для больных в Республике Казахстан.

В результате третьей задачи будет создан первый в стране протокол CAR-T терапии на стадии клинических испытаний I фазы. Первый запланированный результат проекта – технология производства цитотоксических Т-лимфоцитов, направленных против опухолевых клеток при остром лимфобластном лейкозе, является необходимым этапом в ходе создания клинического протокола для внедрения адаптивной клеточной терапии в отечественную онкогематологию.

Цель данного исследования

Путем создания технологии получения аутологических генетически-модифицированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (CAR-T), применение CAR-T-лимфоциты для адаптивной иммунотерапии пациентов с лейкозом.

Задачи исследования

  • Выделение CD8+ лимфоцитов иммуномагнитной сепарацией, активация Т-лимфоцитов.
  • Проведение трансдукции Т-лимфоцитов CAR-T вектором.
  • Измерение цитотоксической активности CAR-Т-лимфоцитов in vitro. Культивирование лимфоцитов в станции CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec).
  • Оценка противоопухолевой активности CAR-T-лимфоцитов в экспериментах на животных.

Методы исследования:

  • Выделение Т-лимфоцитов из цельной крови. Цельная кровь будет собрана в пробирки с раствором гепарина. Эритроциты будут разрушены лизисом в гипотоническом буфере. Лейкоциты будут осаждены центрифугированием и фракционированы центрифугированием в градиенте фиколла, отбираем фракцию моноцитов. Выделение CD8+ лимфоцитов иммуномагнитной сепарацией: клетки будут смешаны с биотинилированными антителами против CD8, избыток антител будет удален и клетки будут адсорбированы на магнитные микрочастицы, покрытые стрептавидином. Дальнейшее выделение будет проводится на колонке MACS LS (Miltenyi Biotec). Оценка жизнеспособности первичной культуры CD8+ лимфоцитов будет выполнена методом МТТ-теста.
  • Активация Т-лимфоцитов. К первичной культуре T-лимфоцитов будут добавлены микрочастицы покрытые антителами против CD3 и CD В среду инкубации будет добавлен IL2 (40 U/ml). Клетки будут инкубироваться 72 ч для активации пролиферации.
  • Лентивирусная трансдукция Т-лимфоцитов. Для упаковки трансдуцирующего вектора смесь плазмид: вектор с CD19 CAR, геном индукции апоптоза и другими нужными генами будет ко-трансфецирован в смеси с упаковочными плазмидами pVSV-G и pGAG-POL в культуру HEK293T. Трансфекция в предварительных экспериментах будет выполнена с помощью катионных липосом. Трансфекция для получения препаративных количеств упакованного вектора (>5×10^7 FFU) будет выполнена в культуральных флаконах T150, с помощью полиэтиленимина. Сбор вируса будет проведён на 1-3 сутки после трансфекции. Титрование будет выполнено с помощью количественного ПЦР а также путём упаковки трансдуцирующего вектора, экспрессирующего флуоресцентный белок (GFP), с последующим заражением наивной культуры упакованным вектором и подсчётом GFP-позитивных клеток.
  • Приготовление культуры CAR-T-лимфоцитов. Активированные к пролиферации Т-лимфоциты будут трансдуцированы вектором, упакованным в вирионы лентивируса, псевдотипированные белком VSV-G (последний обеспечивает широкий тропизм и способность инфицировать лимфоциты). Будет использована множественность инфицирования MOI=5. Производство препаративных количеств CAR-T-лимфоцитов (>10^7 клеток) будет достигнуто путём инфицирования первичной культуры лимфоцитов во флаконах T Для увеличения эффективности трансдукции в среду инкубации будет добавлен полибрен. Клетки будут инкубироваться в присутствии цитокинов (IL2, IL6) для поддержания пролиферативной активности. Через 24 ч после трансдукции к культуре будет добавлен пуромицин (1-10 мкг/мл) [18]. Культура будет выращиваться в среде с пуромицином для элиминации не трансдуцированных (не-CAR-T) лимфоцитов до экспериментов in vitro и in vivo.
  • Измерение цитотоксической активности CD19 CAR-Т-лимфоцитов in vitro. В экспериментах с мышиными CAR-T-лимфоцитами в качестве тестовой культуры будет использована мышиная В-лимфома А20. В экспериментах с донорскими человеческими CAR-T-лимфоцитами в качестве тестовой культуры будут использованы B-лимфобласты человеческого происхождения: К562 и Raji. Тестовые культуры B-лимфобласты и CAR-T-лимфоциты будут совместно высеяны в культуральные планшеты в соотношении (CAR-T/B) 1:1. В качестве контроля неспецифических реакций вместо CAR-T-лимфоцитов будут использованы немодифицированные Т-клетки. Совместные культуры будут инкубироваться 24 ч, после чего среда инкубации будет собрана для измерения IFNγ и IL12 с помощью коммерческих ИФА наборов. Плотность культур (прямой индикатор цитотоксической активности) будет измерена в MTT-тесте.
  • Культивирование и размножение полученных терапевтических клеток для применения в условиях клинических исследовании. Полученные клеточные популяции буут культивироваться в автоматизированной станции CliniMACS prodigy (Miltenyi biotec). Расходные реагенты и компоненты необходимые для выращивания клеток будут соответствовать требованиям GMP. Будет соблюдена стерильность и отработаны производственные стандарты для полученных CD19 CAR-T-лимфоцитов в влабораторных условиях.
  • Оценка противоопухолевой активности CD19 CAR-T-лимфоцитов в экспериментах на животных. Мышам линии BALB/c будет привита B-лимфома. Мышам (6-8 недель) будет вводиться циклофосфамид (100 мг/кг). На следующий день мышам будет введены клетки линии A20 (5 х 105 клеток/мышь). Лимфома развивается в течение~17 дней. Гематологические показатели будут контролироваться с помощью подсчёта клеток периферической крови. Мыши с подтверждённой лимфомой будут немедленно использованы для CAR-T терапии: в хвостовую вену будут введены CAR-T-лимфоциты (10^7 клеток/кг). Мониторинг выживания мышей будет проводиться в течение 60 дней. Регистрируется выживаемость по сравнению с нелеченной контрольной группой. Животные будут выводиться из исследования в соответствии с протоколом, утверждённым локальным этическим комитетом.
  • Оценка противоопухолевой активности CD19 CAR-T-лимфоцитов в экспериментах на пациентах будет проведена согласно разработанного протокола и стандартных операционных процедур, утверждённых локальным этическим комитетом. Планируется подготовка отдельной бригады врачей отделения онкогематологии ННОЦ (г.Нур-Султан) для применения и отработки тактики лечения пациентов с острым лимфобластным лейкозом. Планируется выполнить терапию по технологии CAR-T для шести пациентов ННОЦ, отвечающих разработанным критериям включения.

Исполнитель исследования:  РГП на ПХВ «Национальный центр биотехнологии» Министерства образования и науки Республики Казахстан